产品货号:
SY0298
中文名称:
BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)
英文名称:
BCA Protein Quantification Kit
产品规格:
500T|2500T|5000T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒可用于比色皿法检测,也可用于微孔板法检测。前者虽需较大量(100μL)的蛋白样品,但由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:20(v/v),从而降低干扰物质带来的影响。后者操作简单方便,仅需少量(10~25μL)的蛋白样品。不过,由于其在检测中使用蛋白样品与BCA工作液的比率为1:8(v/v),某种程度上限制干扰物质的承受浓度以及降低最低检测水平。试剂盒中提供的蛋白标准品为用户制作标准曲线提供了便利。
BCA法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应,即在碱性环境下蛋白质将Cu2+还原成Cu+,产生一种紫蓝色复合物,在562nm处有高的吸光值,该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。BCA蛋白浓度测定法实现了蛋白质浓度测定的简便、灵敏、快速和稳定性。
- 灵敏度高,最小检测蛋白量可达0.2μg,检测浓度下限达到10μg/mL。
- 速度快,比一般的BCA蛋白浓度测定试剂盒显色所用时间短。比传统的Lowry法检测速度约快4倍。
- 线性范围广,20~2000μg/mL浓度范围内有较好的线性范围。
- 不受大部分样品中的化学物质的影响,详情见附表1。
组分 | 500T | 2500T | 5000T |
BCA试剂A | 100mL | 500mL | 2×500mL |
BCA试剂B | 3mL | 15mL | 2×15mL |
蛋白标准品(BSA,2mg/mL) | 5×1mL | 10×1mL | 10×2mL |
保存:试剂盒中的A、B液室温或4℃保存;蛋白标准品长时间不用,可置于-20℃保存,有效期1年。
本货号提供三种规格的BCA蛋白浓度检测试剂盒,比色皿法分别可做50次,250次,500次。酶标法分别可做500次,2500次,以及5000次。
- 使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深,并且显色反应的速度和温度有关,因此需注意保持定时和定温,以确保精确定量。
- 低温或长期保存,若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生。请37℃温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染,则应丢弃,避免对实验结果造成影响。
- 实验操作规范,提高上样量的精确度。
- 每次测定都需做相应的标准曲线,因为显色反应与温度和时间的变化有关,精准的蛋白定量宜每次都做标准曲线。
- 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 本制品仅作科研用途!
一、配制标准品和工作液
- 配制BSA标准品体系
标准品稀释液为蛋白样品的溶解液,原则上蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考表1和表2。
表1:BSA标准品体系配制(比色皿检测,线性范围20~2000μg/mL)
注:如用比色皿检测,每管需加100μL标准品,按3个重复计算,每个浓度至少需配制300μL。Vial 稀释液体积(μL) 2mg/mL BSA体积(μL) BSA终浓度(μg/mL) A 0 100 2000 B 25 75 1500 C 50 50 1000 D 125 75 750 E 150 50 500 F 350 50 250 G 375 25 125 H 395 5 25 I 400 0 0=Blank
表2:BSA标准品体系配制(微孔板检测,线性范围20~2000μg/mL)Vial 稀释液体积(μL) 2mg/mL BSA体积(μL) BSA终浓度(μg/mL) A 0 30 2000 B 9 21 1400 C 12 18 1200 D 15 15 1000 E 21 9 600 F 24 6 400 G 27 3 200 H 49 1 40 I 30 0 0=Blank - 配制BCA工作液
- 计算所需要的总BCA工作液体积。
总BCA工作液体积=(标准品+待测样品)×重复数×每个样品所需要的BCA工作液
注:比色皿检测时每个样品加2.0mL BCA工作液,微孔板检测每个样品加200μL BCA工作液。 - 配制BCA工作液:50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B(A:B=50:1),充分混匀。
注:BCA试剂B加入BCA试剂A中后,迅速浑浊,通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内,室温条件24h稳定。
- 计算所需要的总BCA工作液体积。
二、检测方法
- 比色皿检测方法(样品:BCA工作液=1:20)
- 各取100μL标准品和待测样品加入到反应管中。
- 每管加入2.0mL BCA工作液,混匀。37℃孵育30min。
注:也可室温孵育2h,或者60℃孵育30min。BCA检测蛋白浓度,延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限,以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低,可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。 - 冷却到室温。分光光度计检测,设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。在10分钟内对所有样品读数。
注:由于BCA反应达不到真正的反应终点,即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是,由于室温下生色比率相当低,因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试,不会导致明显错误。 - 根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/mL;Y-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
- 各取100μL标准品和待测样品加入到反应管中。
- 微孔板检测方法(样品:BCA工作液=1:8)
- 各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。
注:样品与工作液比例为1:8,若样品有限,可使用10μL标准品和待检测样品进行检测(即1:20),这时试剂盒的检测范围为125~2000μg/mL。 - 每孔加入200μL BCA工作液,振荡30s充分混匀。盖上微孔板,37℃孵育30min。
- 冷却到室温,在酶标仪上的540~595nm波长范围处检测吸光度,其中562nm波长为最佳。
注:
① 由于酶标板的光径比比色皿短,使得酶标板检测需要更好的样品:BCA工作比率来获得相同的检测灵敏度。若使用高于562nm的检测波长,建议延长孵育时间到2h。
② 延长孵育时间或者提高样品:BCA工作比会增高每个孔的OD562nm净值,并且降低检测下限和工作线性范围。 - 根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/mL;Y-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
- 各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。
附表:BCA蛋白浓度测定的兼容性
试剂 | 耐受浓度 | 试剂 | 耐受浓度 | |
Sodium bicarbonate | 100mM | CytoBuster Protein Extraction Reagent | nointerference | |
Sodium phosphate | 25mM | Deoxycholic acid | 5% | |
2-Mercaptoethanol | 0.01% | Dithioerythritol(DTE) | 1mM | |
Glycercol(pure) | 10% | Dithiothreitol(DTT) | 1mM | |
Glycine-HCl,pH2.8 | 100mM | DMF | 10% | |
HEPES | 100mM | DMSO | 10% | |
Hydrochloric acid | 100mM | EDTA | 10mM | |
Leupeptin | 10mg/L | EPPS,pH8.0 | 100mM | |
Nickel chloride(in TBS,pH8.0) | 10mM | Ethanol | 10% | |
Nonidet P-40(NP-40) | 5%(w/v) | Ferric chloride(in TBS,pH8.0) | 10mM | |
Octyl β -glucoside | 5%(w/v) | Glucose | 10mM | |
Potassium thiocyanate | 3.0M | Glycerol | 10% | |
SDS | 5% | Guanidine-HCl | 4M | |
Sodium acetate,pH4.8 | 200mM | Imidazole,pH7.0 | 50mM | |
Sodium azide | 0.20% | MES,PH6.1 | 100mM | |
Sodium hydroxide | 100mM | Methanol | 10% | |
Sucrose | 40% | MOPS,pH7.2 | 100mM | |
Triton X-100 | 5% | N-Acetyglucosamine(10mM)in PBS,pH7.2 | 10mM | |
Triton X-114,X-305,X-405 | 1% | Octyl β-thioglucpyranoside | 5% | |
Tween-20,Tween-60,Tween-80 | 5% | PIPES,pH6.8 | 100mM | |
Zwittergent | 1% | PMSF | 1mM | |
ACES,pH7.8 | 25mM | PopCulture Reagent | nointerference | |
Acetone | 10% | Reportasol Extraction Buffer | nointerference | |
Acetonitrile | 10% | Sodium chloride | 1M | |
Ammonium sulfate | 1.5mM | Sodium citrate,pH4.8 or pH6.4 | 200mM | |
Aprotinin | 10mg/L | Sodium ortho-vanadate in PBS,pH7.2 | 1mM | |
Bicine,pH8.4 | 20mM | Span 20 | 1% | |
Bis-Tris,pH6.5 | 33mM | TBS(150mM NaCl,100mM Tris-HCl,pH8.0) | nointerference | |
Borate,pH8.5 | 50mM | Thimerosal | 0.01% | |
Brij-35 | 5% | TLCK | 0.1mg/L | |
Brij-52 | 1% | TPCK | 0.1mg/L | |
Brij-56,Brij-58 | 1% | Tricine,pH8.0 | 25mM | |
BugBuster protein Extraction Reagent | nointerference | Triethanolamine,pH7.8 | 25mM | |
Calcium chloride(in TBS,pH8.0) | 10mM | Tris | 250mM | |
CelLytic B Reagent | nointerference | Tris(hydroxypropyl)phosphine(THP) | 1mM | |
Cesium bicarbonate | 100mM | Urea | 3M | |
CHAPS | 5% | Zinc chloride(in TBS,pH8.0) | 10mM | |
Cobalt chloride(in TBS,pH8.0) | 0.8mM |
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